PCR产品的检测

• 凝胶电泳剖析：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 酶切剖析
• 分子杂交：Southern印迹杂交、黑点杂交
• 核酸序列剖析

PCR的反映条件

• 反映温度（变性、退火、延伸）
• 反映时间（变性、退火、延伸）
• 循环次数（PCR效率及产品量）

PCR反映的特点

• 特异性强：引物与模板连系的特异性及聚合酶的忠实性  
• 迅速度高：指数增添，，，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 
• 轻盈、快速：2～4 小时完成扩增
• 对标本的纯度要求低：DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板 

1.1 PCR手艺概述及原理

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反映，，，是在DNA聚合酶的催化下，，，以特定的DNA为模板，，，以特定的核酸片断即PCR引物为扩增起点和终点，，，通过变性、退火、延伸等方法，，，在体外系统中复制出大宗与母链模板中所需的DNA片断互补的子链DNA的历程。。
PCR的最大特点是其扩增产品的特异性、扩增效率的迅速性、扩增程序的轻盈性。。引物序列及其与模板连系的特异性是决议PCR反映效果的要害。。PCR手艺是一种DNA体外合成放大手艺，，，具有扩增效率高，，，扩增特异性高，，，扩增系统和手艺轻盈成熟的特点，，，是当今生物学相关实验室最普遍使用的一项手艺。。

1.1.1 PCR的循环方法

PCR反映历程现实上是一个温度循环转变的历程，，，一般包括变性---退火---延伸三个基本反映方法，，，其基本方法如下：
（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至92～96℃以上保温1～3分钟，，，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，，，使之成为单链，，，以便它与引物连系，，，为下轮反映作准备；；；；虽然变性时间决议于多种因素模板DNA的重大性、反映管的几何学、PCR仪的种类甚至反映体积，，，可是现实履历中，，，94℃保温3分钟即可以知足绝大部分反映的需求。。另外，，，关于GC含量较高的DNA模板，，，加入甘油、延伸时间、应用核酸类似物可以提高PCR产品的产量。。
（2）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，，，37～65℃保温0.5～1分钟，，，寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补序列配对连系；；；；这一步的温度取决于引物与靶序列的同源性水平和寡核苷酸引物的碱基组成。。引物的摩尔数由于绝对大于靶序列，，，因此它们与互补序列的配对速率在反映中比模板双链之间的重新配对要快几个数目级。。
（3）引物的延伸：DNA模板---引物连系物系统在68～72℃延伸保温响应时间（此方法详细温度视热稳固DNA聚合酶的种类而定，，，而保温时间则在思量DNA聚合酶效率的基础上，，，依据反映产品的长度决议，，，如现在最常用的DNA聚合酶Taq酶在72℃下每分钟约可以扩增添度为1Kb左右的DNA片断，，，因此要扩增两2Kb的DNA片断时本方法的保温温度应设置为72℃、时间为2分钟），，，在DNA聚合酶的作用下，，，以dNTP为反映质料，，，靶序列为模板，，，按碱基配对与半保存复制原理，，，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保存复制链。。

重复循环变性---退火---延伸三历程，，，就可获得更多的“半保存复制链”，，，并且这种新链又可成为下次循环的模板使得每个循环中新扩增的目的片断数目以指数式增添。。经由一定命目的循环之后，，，待扩目的DNA片断的数目将被扩增放大几百万倍。。抵达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。。

1.1.2 PCR一般反映系统

PCR反映的组分一般包括：（1）模板DNA；；；；（2）引物；；；；（3）四种脱氧核糖核苷酸；；；；（4）DNA聚合酶；；；；（5）反映缓冲液、Mg2+等。。现在，，，PCR反映已经所有在PCR仪中举行，，，且普遍接纳商业化的PCR试剂盒举行PCR反映，，，因此一般研究者只需要准备自己的模板DNA和PCR引物，，，然后凭证产品说明书举行操作即可；；；；关于PCR系统各个组分的相识是举行PCR实验的基。。，，尤其是在扩增效果不睬想的时间，，，可依此刷新实验以获得知足实验需求的扩增效果。。

一般通俗的PCR反映系统中主要包括下列组分：
（1）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，，，通常标准分子生物学要领制备的样品都可以直接作为模板使用，，，无需特殊处理，，，但应只管不含有对PCR反映有抑制作用的杂质保存，，，如卵白酶、核酸酶、聚合酶抑制剂、能与DNA连系的卵白质。。需要指出的是，，，模板DNA的量不可太高，，，否则扩增可能不会乐成，，，在此情形下可适当稀释模板。。另质粒、预先扩增的到的片断等小片断DNA作模板时，，，扩增的效率会显着高于基因组DNA为模板的反映，，，因此在使用小片断DNA作模板时，，，要只管降低模板的量，，，10-9g至10-12g级即可。。
（2）引物：引物在PCR反映中的终浓度一般为1μmol/L，，，浓度过高会引起错配和非特异扩增，，，浓度过低则得不到产品或产量过低。。商业公司合成的干粉状引物一般可用ddH2O或消融为100μmol/L，，，－20℃贮存，，，使用时按比例加入系统即可。。
（3）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，，，其贮存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，，，一般存储浓度为10mmol/L，，，各成份以等当量配制，，，反映终浓度为20～200μmol/L。。高浓度可加速反映，，，但同时增添过失掺入和实验本钱；；；；低浓度可提高准确性，，，而反映速率会降低。。需要说明的是，，，dNTPs的浓度改变会影响有用的Mg2+浓度，，，因此若dNTPs得浓度增添，，，Mg2+浓度亦应该增添。。
（4）镁离子：Mg2+能影响反映的特异性和PCR的产率。。Mg2+的事情浓度为1.5～2.0mM，，，其对应dNTP为200μmol/L；；；；以Taq酶为例，，，由于dNTP与Taq酶竞争Mg2+，，，当dNTP浓度抵达1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。。镁离子的使用是严酷的，，，其作用优于锰离子，，，钙离子则无效。。
（5）无Mg2+buffer：主要有H2O、KCl、Tris组成。。Tris用于控制反映系统中的pH值，，，包管DNA聚合酶的反映活性；；；；不凌驾50mM的KCl可以降低退火温度，，，可是过高的KCl会抑制DNA聚合酶的活性。。
（6）DNA聚合酶：DNA聚合酶是PCR扩增得以举行的包管，，，现在的PCR手艺中使用的都是热稳固性酶，，，阻止了PCR手艺应用初期需在每一次变性后重腥蚊的繁琐事情。。现在最常用的Taq酶能耐95℃高温而不失活，，，其最适pH值为8.3～8.5，，，最适温度为75～80℃，，，一般用72℃。。能催化以DNA单链为模板，，，以碱基互补原则为基。。，，按5’→3’偏向逐个将dNTP分子毗连到引物的3’端，，，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。。Taq酶的弱点是没有3’→5’的外切酶活性，，，因此没有校正功效，，，某种dNTP或Mg2浓度过高,会增添其错配率，，，因此在举行细密PCR实验室，，，建议使用有3’→5’的外切酶活性的高保真的聚合酶。。聚合酶的用量一般按试剂盒说明书的推荐用量添加即可。。
除了以上标准因素以外，，，一些研究者或者试剂盒推荐在系统中添加明胶、TritonX-100或BSA（小牛血清白卵白）来增添酶的稳固性，，，可能的原因是它们起着镌汰PCR管对聚合酶的吸附作用，，，以使聚合酶尽可能加入到反映中。。
另外，，，甘油、二甲亚砜、甲酰胺可以提高特异性,这些因素可能是通过降低解链和链疏散温度使模板变性更容易并提高了引物退火特异性来实现提高PCR反映特异性的目的。。

1.2引物设计

1.2.1 PCR引物设计的一般头脑

PCR反映扩增乐成的一个要害即是引物的准确设计，，，尤其在现在已有大宗PCR试剂盒免去研究职员对实验系统、条件的繁复探索的条件下，，，研究者只需自行准备模板和引物即可。。
引物设计的焦点头脑是在扩增的特异性和效率之间取得平衡。。特异性指扩增获得非目的片断的频率；；；；扩增效率指在每一个循环中一对引物引起的扩增产品的产量与理论上应获得的产量的靠近水平。。
现在市面上提供大宗的引物设计软件，，，这些软件基本都基于以下几点思量引物质量：可能引起非靶序列的假阳性扩增，，，引物自己的发卡结构，，，引物二聚体的形成等，，，假阳性扩增与引物特异性相关，，，引物发卡结构和二聚体的形成对扩增效率有较大影响。。

1.2.2引物的组成

引物的主体通常是一段5’→3’的与靶序列严酷互补的寡核苷酸短链，，，凭证实验的差别目的，，，许多时间会在引物的5’添加限制性酶识别位点等与本次PCR无关序列或其它种种修饰,这些修饰通常不会影响引物的第一次正常退火和扩增，，，而在后续的循环中，，，由于已有可互补的模板，，，系统亦可正常举行扩增。。

1.2.3引物设计时应思量的几个因素

（1）引物长度：PCR扩增的特异性由引物的长度和退火温度控制，，，当反映的退火温度靠近Tm值时，，，18～24个碱基长度的引物有着卓越的特异性。。
理论上以为在引物上每增添一个碱基特异性会增添4倍，，，因此引物越长碱基数越多特异性越突出，，，可是引物越长，，，退火时可以被其引发的模板也会越少，，，再经由指数扩增期放大后，，，扩增产品会显着镌汰。。因此若非特殊需要，，，一般引物的互补序列部分不需要凌驾25个碱基。。
而引物越短，，，其在退火时连系到靶序列上的几率就越高，，，因此引物中与靶序列互补部分碱基太少会引起不须要的非目的扩增产品。。
（2）GC%和Tm值：Tm值指的是引物与模板连系的双链体的解链温度。。较低的Tm值导致引物特异性的损失，，，这种情形下将泛起大宗的非特异性扩增产品。。Suggs在1981年提出的Tm＝2（A+T）+4（C+G）公式，，，由于轻盈和相对准确一直受到宽大研究者的好评。。关于一条约莫20个碱基的引物，，，基于上述公式，，，可以发明当CG%在50%左右时Tm值约在56℃～62℃，，，较适合举行PCR反映，，，因此在设计引物时，，，应选。。ˋ+T）和（C+G）数目大致相当的序列。。尤其应注重使上下游两条引物的Tm值只管靠近，，，较量理想的情形是相差2～3℃以内，，，这样可以使PCR反映中举行退火时上下游引物连系靶序列的效率相当，，，以获得稳固且足够数目的扩增产品。。
需要特殊指出的是，，，在举行PCR反映设置退火温度时，，，不管是公式推算照旧软件预测或者引物合成公司提供的Tm值，，，现实上都只能用于参考，，，每一个PCR反映的现实退火温度理论上都是未知的，，，通常第一次扩增时退火温度设置为参考Tm值+2或4℃，，，之后凭证扩增效果举行调解。。
（3）引物在靶序列内的位置：除了有特定而准确的目的片断以外，，，大部分的实验中，，，PCR反映的产品长度是可以在一定规模内举行适度选择的，，，凭证PCR产品的用途、模板的特点和所用聚合酶的特征，，，可以选择合适的产品长度，，，一般实验中的PCR反映通常选择在150～1000bp之间，，，而若只是为了检查某段特异性序列则只需要120～300bp就已足够。。
在靶序列上选择引物的时间，，，注重避开成串简单碱基的区域，，，避开连续的CG序列，，，只管选择四个碱基漫衍较随机的区域，，，这样可以镌汰引物自身同源的时机，，，阻止扩增历程中引物的不须要消耗；；；；同时在上下游两引物之间也不应有互补链保存，，，不可与非目的扩增区有同源性。。另外尤其要注重3’最后的序列，，，若非有特定作用，，，这段序列一定要与模板DNA严酷配对，，，末位碱基最好选用A、C、G，，，由于T错配也能引发链的延伸。。

1.3 PCR的特异性、效率和忠实性

PCR的特异性、效率和忠实性是体现一个PCR实验的质量的三个主要指标。。特异指一个PCR反映只爆发一个扩增产品，，，即预期的靶序列。。效率指每个循环里扩增的现实产品的量与理论上应该抵达的量的靠近水平。。忠实是指在PCR反映历程中，，，由DNA聚合酶诱导的错配是可以忽略不计的。。
这三个参数中的每一个都受到PCR反映中众多因素的影响，，，包括缓冲系统、酶、模板甚至PCR循环程序，，，但最遗憾的是，，，高特异性的反映条件与高产量的反映条件并纷歧致，，，同时高保真也往往导致低产率。。因此在设计PCR实验时，，，要凭证实验目的，，，有针对性地对这三个参数有着重地优化。。如在片断长度多态性剖析时，，，PCR产品的产量和特异性就比忠实性主要；；；；而若是研究个体DNA分子或有数突变，，，忠实性的主要性不言而喻。。
特异性是PCR的基。。，，它首先取决于引物设计与模板的准确互补。。一套理想的引物能有用地与靶序列杂交，，，而与模板中泛起的其它序列的杂交可以忽略不计。。一般引物与模板中非靶序列爆发4个或更少连续碱基互补都不会在电泳时体现出来。。
PCR反映的效率影响特异性产品的积累，，，凭证Chien等人给出的靶序列的累积与循环数的函数关系，，，扩增效率最高的时期为29个循环之前的指数增恒久，，，之后每次循环的效率就最先大大降低，，，产品阻止指数积累，，，此时理论上靶序列的拷贝数已抵达1012，，，而1012拷贝的特定序列关于绝大大都分子生物学实验已知足要求，，，且PCR的许多应用尤其是定量实验都要求扩增在指数生恒久完成，，，因此，，，一般PCR反映都在29个循环之前取出，，，没有须要再增添循环数。。
PCR反映的忠实性主要与酶有关，，，虽然可以通过改变反映缓冲液的条件大大提高忠实性，，，可是也远比不上替换高保真的聚合酶的效果。。聚合酶的高保真能力体现在其拥有3’→5’的外切酶校正活性。。需要指出的是，，，岂论是否使用高保真的聚合酶，，，PCR的历程都有可能有过失碱基渗入，，，因此在对忠实性有要求的实验中，，，经PCR获得的序列必需测序验证。。

1.4 PCR的优化

在PCR实验中，，，最显而易见的一对矛盾是扩增时爆发大宗不确定、不需要的产品，，，或者没有扩增到任何产品，，，这个矛盾的实质就是PCR的高特异性和高效率所需的条件纷歧致。。
下面给出有利于增添PCR特异性的部分条件，，，往反偏向调解即可增添扩增效率，，，可是会降低特异性，，，因此最佳目的是衙院个偏向之间的平衡。。

有利于增添PCR特异性的调解条件：
（1）使用热启下手艺
（2）使用下降PCR手艺
（3）优化引物设计
（4）加入或优化增强剂
（5）优化反映系统，，，包括pH值，，，甚至改变反映体积
（6）提高退火温度
（7）提高模板的变性效率
（8）降低Mg2+浓度
（9）降低dNTPs的浓度
（10）降低聚合酶的量
（11）降低引物浓度
（12）降低模板浓度
（13）镌汰循环数
（14）镌汰每个循环中各部分的时间
如上所述，，，通常影响一个PCR反映的条件许多，，，因此，，，在现实操作中若是举行全矩阵剖析寻找最佳条件将费时艰辛，，，因此，，，研究历程中可以只针对相关的主要变量举行调解。。在重点思量引物与模板的配对及酶的忠实性的情形下，，，Mg2+浓度和退火温度是对扩增影响最显著的因素，，，因此可以只针对这两个变量举行简朴的小矩阵剖析。。下降PCR实质上就是一个在系列梯度温度中寻找到有用退火温度，，，并适度包管特异性的要领。。

1.5 PCR常见问题

PCR产品的电泳检测与生涯
PCR竣事后最好连忙检测，，，一般不要凌驾48小时；；；；产品生涯于－20℃待用，，，或者纯化后生涯。。

假阴性，，，不泛起扩增条带
PCR反映的要害环节有：（1）模板核酸的制备；；；；（2）引物的质量与特异性；；；；（3）酶的质和量；；；；（4）PCR循环条件。。寻找原因亦应针对上述环节举行剖析研究。。
模板：（1）模板中含有杂卵白质；；；；（2）模板中含有Taq酶抑制剂；；；；（3）模板中卵白质没有消化除净，，，特殊是染色体中的组卵白；；；；（4）在提取制备模板时丧失过多，，，或吸入酚；；；；（5）模板核酸变性不彻底。。在酶和引物质量好时，，，不泛起扩增带，，，极有可能是标本的消化处理，，，模板核酸提取历程出了毛。。，，因而要配制有用而稳固的消化处理液，，，其程序亦应牢靠不宜随意更改。。
酶失活：需替换新酶，，，或新旧两种酶同时使用，，，以剖析是否因酶的活性损失或不敷而导致假阴性。。需注重的是有时忘加Taq酶。。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，，，是PCR失败或扩增条带不睬想、容易弥散的常见原因。。有些批号的引物合成质量有问题，，，两条引物一条浓度高，，，一条浓度低，，，造成低效率的差池称扩增，，，对策为：（1）选定一个好的引物合成单位；；；；（2）引物的浓度不但要看OD值，，，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，，，一定要有引物条带泛起，，，并且两引物带的亮度应概略一致，，，如一条引物有条带，，，一条引物无条带，，，此时做PCR有可能失败，，，应和引物合成单位协商解决。。如一条引物亮度高，，，一条亮度低，，，在稀释引物时要平衡其浓度；；；；（3）引物应高浓度小量分装生涯，，，防止多次冻融或恒久放冰箱冷藏部分，，，导致引物变质降解失效；；；；（4）引物设计不对理，，，如引物长度不敷，，，引物之间形成二聚体等。。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，，，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，，，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。。
反映体积的改变：通常举行PCR扩增接纳的体积为20μl、30μl、50μl，，，或100μl，，，应用多概略积举行PCR扩增，，，是凭证科研和临床检测差别目的而设定，，，在做小体积如20μl 后，，，再做概略积时，，，一定要模索条件，，，否则容易失败。。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当主要，，，如变性温度低，，，变性时间短，，，极有可能泛起假阴性，，，退火温度过低，，，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的连系而降低PCR扩增效率。。有时尚有须要用标准的温度计，，，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，，，这也是PCR失败的原因之一。。
靶序列变异：如靶序列爆发突变或缺失，，，影响引物与模板特异性连系，，，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，，，其PCR扩增是不会乐成的。。

假阳性，，，泛起扩增条带与目的靶序列条带一致
有时泛起的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，，，其条带更整齐，，，亮度更高。。
引物设计不对适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，，，因而在举行PCR扩增时，，，扩增出的PCR产品为非目的性的序列。。靶序列太短或引物太短，，，容易泛起假阳性。。需重新设计引物。。
靶序列或扩增产品的交织污染：这种污染有两种原因：（1）整个基因组或大片断的交织污染，，，导致假阳性。。这种假阳性可用以下要领解决：操作时应小心轻柔，，，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。。除酶及不可耐高温的物质外，，，所有试剂或器材均应高压消毒。。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。。须要时，，，在加标本前，，，反映管和试剂用紫外线照射，，，以破损保存的核酸。。（2）空气中的小片断核酸污染，，，这些小片断比靶序列短，，，但有一定的同源性。？？
？上嗷テ唇樱，，与引物互补后，，，可扩增出PCR产品，，，而导致假阳性的爆发，，，可用巢式PCR要领来减轻或消除。。

泛起非特异性扩增带
PCR扩增后泛起的条带与预计的巨细纷歧致，，，或大或。。，，或者同时泛起特异性扩增带与非特异性扩增带。。非特异性条带的泛起，，，其原因：（1）引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。。（2）Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，，，及PCR循环次数过多有关。。（3）酶的质和量，，，往往一些泉源的酶易泛起非特异条带而另一泉源的酶则不泛起，，，酶量过多有时也会泛起非特异性扩增。。其对策有：须要时重新设计引物。。减低酶量或替换另一泉源的酶。。降低引物量，，，适当增添模板量，，，镌汰循环次数。。适当提高退火温度或接纳二温度点法（93℃变性，，，65℃左右退火与延伸）。。

泛起片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时泛起涂抹带或片状带或地毯样带。。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，，，dNTP浓度过高，，，Mg2+浓度过高，，，退火温度过低，，，循环次数过多引起。。其对策有：（1）镌汰酶量，，，或替换另一泉源的酶。。（2）镌汰dNTP的浓度。。适当降低Mg2+浓度。。增添模板量，，，镌汰循环次数。。

1.5 PCR的应用

PCR手艺自1985年建设以来，，，生长迅速，，，体现出极其普遍的应用价值.基于PCR的基来源理，，，许多学者充分验展创立性头脑，，，对PCR手艺举行研究和刷新，，，使PCR手艺不但获得了进一步地成熟完善，，，更在此基础上派生出了许多新的应用领域与要领。。

PCR手艺首先在基因工程领域有着不可替换的孝顺：
对DNA片断在按特殊要求举行修饰上PCR手艺提供了一种比原有手艺更快更简朴的要领。。由于与重组DNA手艺相比，，，PCR手艺自己就较为简朴；；；；并且它还可以通过化学合成寡聚核苷酸引物的要领更为轻盈地改变DNA的碱基序列，，，而不需对DNA片断举行限制性内切酶和毗连酶操作；；；；再者，，，PCR手艺还可能很利便地举行序列刷新，，，如在引物5'端加上一个“添加”序列。。别的PCR手艺爆发的修饰产品效率险些可达100%。。
别的通过PCR引物引入DNA序列变异的原理是很是有用的。。最为轻盈的是它可以使PCR产品的一条链或另一条链或两条链都特异性地标记上放射同位素、生物素或荧光素。。它还可以在DNA序列的任一位置上特异性地举行位点替换、缺失、插入或重组，，，同时它还可以将原来绝不相关的序列准确地毗连起来，，，并由此获得可遗传的突变。。
近年来，，，基于PCR的种种新手艺一直更新、完善、生长，，，如原位PCR手艺、毗连酶链反映手艺（Ligase chain reaction，，，LCR）、依赖核酸序列的扩增手艺（Nucleic acid sequence-based amplification，，，NASBA）、转录依赖的扩增系统（Transcript-based amplification system，，，TAS）、标记PCR手艺（Labelled Primers，，，LP-PCR）、彩色PCR手艺（Color Complementation assay PCR，，，CCAPCR）、反向PCR手艺（reverse PCR）、差池称PCR手艺（asymmetric PCR）以及现在热火朝天的实时荧光定量手艺（real time PCR）等等，，，不但应用在科研领域，，，也在动、植物检疫、食物清静、司法判断等社会生涯中的方方面面有着越来越大的应用价值。。希望通过自己的起劲，，，使其成为一名玩PCR的能手。。

【主要参考书目】
（1）C.W.迪芬巴赫，，，G.S.德维克斯勒，，，PCR手艺实验指南．科学出书社：北京，，，2000
（2）萨姆布鲁克 J，，，弗里奇 E F，，，曼尼阿蒂斯 T．分子克隆实验指南．第二版．北京：科学出书社，，，1998